• 关注微信
  • |
  • 中文
  • |
  • English

vns威尼斯城官网登入

关注生之源微信 获取更多信息

怎样解决RNAi的脱靶问题

日期:2014-07-16 00:00:00

在使用杀伤性武器的时候,不伤及无辜很重要,对于RNA干涉(RNAi)来说也是如此。RNAi是一种常用的基因失活工具,它的主要缺陷在于会引起序列特异性的脱靶效应。这样的脱靶效应很难预测,因为siRNA能够影响与它部分互补的序列,像miRNA那样抑制基因的表达。

要减少脱靶效应,可以将针对同一mRNA的不同siRNA混合起来使用。这些siRNA作用于同一个目标,每种siRNA的浓度得以降低,稀释了各自的脱靶效应。然而,这一策略在实际操作中面临着两个问题。其一,目前“Smart pools”只包括四个合成的siRNA,复杂性还不足以显著减少脱靶效应,而合成更多siRNA的成本又太高。其二,利用Dicer或RNase III消化dsRNA时,siRNA混合物中会出现长度各异的剪切产物,进而引发许多问题。

日前,Regensburg大学的Gunter Meister领导研究团队在Nucleic Acids Research杂志上发表文章,描述了一种能克服上述问题的新方法。这种被称为siPools的低成本方法,能够简单而精确的生成含有多达60种siRNA的混合物,将脱靶效应降低到检出限以下。

据先容,siPools的关键一步是,设计针对同一个基因的几十种siRNA,并将这些序列结合到一个DNA模板上,不同siRNA序列之间以短序列相连。这些模板经过转录、退火和酶切就能生成成分明确的siRNA混合物。

为了验证siPools的效果,研究人员选择人类基因POLG和SCYL1作为RNAi的靶标。之前有研究显示,针对这两个基因的siRNA很容易影响到MAD2基因的表达,因此它们可以作为检测脱靶效应的理想对象。

研究人员针对这两个基因,分别设计了含有60个siRNA的siPools,然后用它们转染HeLa细胞。研究显示,在浓度相同的情况下,siPools敲低目标基因与单个siRNA一样有效。

这两个siPools都含有一个MAD2脱靶效应很强的siRNA。然而在转染之后,MAD2上并未发生可检测到的脱靶影响。研究人员随后又通过萤光素酶报告基因证实了这一点。

此外,研究人员还进行了全转录组的芯片分析。他们发现,单个脱靶siRNA除了MAD2以外还大大减少了许多其他的转录本,但siPools对MAD2和总体转录本水平都没有影响。这说明,将大量siRNA混合起来的确能够大大降低RNAi的脱靶效应。下一步,Meister将进一步评估siPools在活体内作用效果。

值得注意的是,Meister等人还将siPools成功用于长非编码RNA(lncRNA)。单个siRNA往往难以对lncRNA施加影响,这可能是因为单个siRNA难以接触到高度结构性的lncRNA分子。现在,研究团队正在构建针对lncRNA的siPool文库。